億迅生物-實時熒光定量PCR實驗科普，快來圍觀

技術(shù)簡介：

實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。·

Real-timePCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。

技術(shù)應(yīng)用：

1 核酸定量分析：對傳染性疾病進行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測 , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 轉(zhuǎn)基因動植物基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。

2 基因表達差異分析： 比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學處理等 ) ，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA芯片或差顯結(jié)果的確證。

3 SNP 檢測：檢測單核苷酸多態(tài)性對于研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義，因分子信標結(jié)構(gòu)的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進行高通量的 SNP 檢測將會變得簡單而準確。

4 甲基化檢測：甲基化同人類的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥， Laird 報道了一種稱作 Methylight的技術(shù)，在擴增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。

正確分析結(jié)果：

1、如果有標準曲線，按照標bai準曲線計算；

2、一般都是相對量，則zhi用delta delta CT方法來計算；

3、引物或探dao針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性；

4、模板量不足：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的高濃度做起；

5、看CT值是分析熒光定量PCR較直觀的一個數(shù)據(jù)，CT值一般在35左右就失去參考價值了，平時我們實驗室用BIODAI-PCR熒光定量法測得的擴增曲線的起跳值基本在30左右。

將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實時檢測與之對應(yīng)的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值，同時利用數(shù)個已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數(shù)。

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