簡介分光光度法

一、基本原理

光線是高速運動的光子流，也是具有波長和頻率特征的電磁波。光子的能量與頻率成正比，與波長成反比。肉眼可見的光線稱為可見光?？梢姽庵徽茧姶挪ㄗV的很窄部分(400nm到760nm)。不同波長的可見光具有不同的顏色。波長大于760nm的光線稱為紅外線。波長小于400nm的光線稱為紫外線。

當(dāng)一束白光通過一杯有顏色的溶液時，具有一定波長的光線選擇性的被溶液所吸收。不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同，對不同波長光線的吸收能力不同，因此每種物質(zhì)都具有其特異的吸收光譜。吸收光譜的測定可以用來鑒定各種不同的物質(zhì)。例如核黃素之所以呈現(xiàn)黃色，是由于它僅吸收可見光中的藍(lán)光范圍，并測得其吸收峰在450nm（圖1-3）。在紫外光范圍它還有兩個吸收峰。它們分別是260nm和370nm。

分光光度法常被用來測定溶液中存在的光吸收物質(zhì)的濃度。其理論依據(jù)是郎伯—比爾(Lambert-Beer)定律。

 （核黃素22mmol/L溶于0.1mol/L  磷酸鈉中，pH7.06，吸收杯厚1cm）

（一）郎伯定律(Lambert’s Laws)

一束單色光在通過一溶液時，由于溶液吸收一部分光能，使光的強(qiáng)度減弱。若溶液的濃度不變，則溶液的厚度愈大，光強(qiáng)度的減弱也愈顯著(圖1-4)

若I₀表示入射光強(qiáng)度，I表示光線通過溶液后的強(qiáng)度，L表示溶液的厚度。

得：InI=－αL＋C       當(dāng)Ｉ=0時，I=I₀，所以C=InI₀    即  InI=－αL＋I(xiàn)nI₀

K₁是一常數(shù)，受光線波長、溶液性質(zhì)和溶液濃度影響。從上述公式可知，透過溶液后，光強(qiáng)度的減弱（I/I₀）與溶液厚度（L）呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系?？梢姽鈴?qiáng)度的改變與溶液厚度并不呈簡單的正比關(guān)系。這一關(guān)系就是郎伯定律。

 （二）比爾定律(Beer’s Law)

當(dāng)一束單色光通過一溶液時，若溶液的厚度不變，則溶液濃度愈高，光線強(qiáng)度減弱也愈顯著，與上定律相似。兩者的關(guān)系可以表示如下：

其中，C表示溶液的濃度。K₂是一常數(shù)，受光線波長、溶液性質(zhì)和溶液厚度的影響。上述公式所表示的光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系稱為比爾定律。

雖然所有的溶液均符合郎伯定律，但并非所有的溶液都符合比爾定律。這是由于有些物質(zhì)在不同濃度條件下其顏色可能發(fā)生改變，即在不同濃度條件下其吸收光的波長發(fā)生改變。常見的原因如下：

    1．有些有色物質(zhì)在溶液中可能解離成相應(yīng)的離子，離子的顏色與分子的顏色不同，造成對比爾定律的誤差。

2．有些物質(zhì)在較高濃度狀態(tài)下可形成絡(luò)合物，絡(luò)合物使吸收光譜發(fā)生改變。例如：氯化鈷在稀溶液中呈玫瑰色，而在濃溶液中呈藍(lán)色。

CoCl₂ + CoCl₂→Co2+ (CoCl₄)2-

玫瑰色         藍(lán)色

3．氫離子濃度和電解質(zhì)也可引起一些有色物質(zhì)顏色的改變，這些改變也可能造成比爾定律的誤差。

（三）郎伯——比爾定律及其應(yīng)用

一般將通過溶液后的光線強(qiáng)度（I）和入射光（Io）的比值稱為透光度(transmittance, T)，將-Log  用光密度(Optical density, O.D.或D)表示，以反映該溶液對光吸收的情況。有時也用吸光度(absorbance, A)表示。則它們之間的關(guān)系如下

其中，Ｅ為消光系數(shù)(Extinction coefficient), 表示物質(zhì)對光線吸收的本領(lǐng)，其值因物質(zhì)種類和光線波長而異。

從公式（1）可知對于相同物質(zhì)和相同波長的單色光（消光系數(shù)不變）來說，溶液的光密度和溶液的濃度呈正比。

如果C₂為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，則可根據(jù)測得的光密度值，按公式（2）求得待測溶液的濃度。

實際工作中為簡便起見，常常不是每測一個待測樣品都做一個標(biāo)準(zhǔn)管，而是事先測定一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)管，然后以光密度對標(biāo)準(zhǔn)濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得待測物質(zhì)的光密度后，便可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到相應(yīng)的濃度數(shù)值。

從公式（1）可知，若知道某待測物質(zhì)的消光系數(shù)和溶液的厚度，也可以從光密度推算出待測溶液的濃度。消光系數(shù)的常用表示方法有二：

1．百分消光系數(shù)（E1%_1cm）；濃度以百分濃度來表示的消光系數(shù)。百分消光系數(shù)等于濃度為1%，液層厚度為1cm的光密度值。

2．克分子消光系數(shù)（ε）；濃度以摩爾濃度來表示的消光系數(shù)?？朔肿酉庀禂?shù)等于溶液濃度為1個摩爾濃度，液層厚度為1cm的光密度值。

用消光系數(shù)計算濃度的公式是： 

例：一蛋白質(zhì)溶液在其吸收峰λ=278nm處的光密度D=0.520，吸收杯厚度為1.00cm，已知E1%_1cm278=5.10，則此蛋白質(zhì)溶液的濃度為 

 二、

幾種常用的國產(chǎn)分光光度計

（一）721型分光光度計（圖1-7）   

這是一種采用光電管為受光器的較高級可見光分光光度計。由穩(wěn)壓電源供電的光源燈發(fā)出穩(wěn)定的白光。如圖1-7所示。光線經(jīng)反射鏡投入狹縫，再經(jīng)準(zhǔn)直鏡反射進(jìn)入棱鏡，在棱鏡中發(fā)生色散后，光線經(jīng)鋁面反射后，其中一部分經(jīng)原路返回，并穿過狹縫，透過反射鏡進(jìn)入吸收杯。從吸收杯射出的光線再經(jīng)光門射到光電管上，產(chǎn)生相應(yīng)的電流，并經(jīng)電流表指示出相應(yīng)的刻度值。

其中色散棱鏡裝在一個可以轉(zhuǎn)動的圓盤上，旋轉(zhuǎn)波長選擇鈕可使之發(fā)生偏轉(zhuǎn)，使不同波長的光線通過狹縫形成一定波長的單色平行光線。同時，波長盤也隨之轉(zhuǎn)動以指示波長數(shù)字。此型分光光度計給出360~800nm范圍的波長，在410-710nm之間靈敏、適用。使用方法如下（各調(diào)節(jié)部位參看圖1-8）。

1．靈敏度選擇鈕放在“1”檔（如調(diào)不到“0”時，再選用較高的檔）。

2．轉(zhuǎn)動波長選擇鈕，選用所需的波長。

3．接通電源（指示燈亮）。

4．揭開比色皿暗箱蓋，轉(zhuǎn)動“0”位鈕，使電表指針對準(zhǔn)T=0處。

5．將比色杯杯放入比色杯架上，使空白管對向光路，蓋好比色皿暗箱蓋，轉(zhuǎn)動“百位鈕”調(diào)準(zhǔn)電表指針使之指向D=0（T=100處）。

6． 拉動比色皿座的拉桿，使測定杯進(jìn)入光路，迅速從電表上讀出光密度值，記錄。測讀過程中，隨時將拉桿推回到原位，使空白杯進(jìn)入光路，并轉(zhuǎn)動“百位鈕”，使指針回到D=0處。

7． 比色完畢后，關(guān)上電源開關(guān)，取出比色杯，將比色皿暗箱蓋蓋好，清洗比色皿并空干。

8． 注意事項

（1）光電比色計屬精密儀器，應(yīng)精心愛護(hù)使用，要防震、防潮、防腐蝕。

（2）比色杯的好壞對光密度讀數(shù)的影響很大，要保持比色杯的清潔干凈，保護(hù)光學(xué)面的透明度，不能手握光學(xué)面，也不能用粗糙的物體接觸光學(xué)面，比色杯中的液體應(yīng)適量，不應(yīng)過滿，比色杯外壁的液體應(yīng)用擦鏡紙擦干，以防腐蝕儀器和影響讀數(shù)。如比色液為強(qiáng)酸強(qiáng)堿，應(yīng)盡快比色，以防破壞比色杯。

（3）比色時間應(yīng)盡量縮短，以防光電系統(tǒng)疲勞。如需連續(xù)使用，中間應(yīng)適當(dāng)暫停使用，使之避光休息。

（二）UV-754型分光光度計

這是一種可供在紫外到紅外區(qū)（200-1000nm）測量吸收光譜的較高級分光光度計。此儀器的光學(xué)部分與721型分光光度計相類似，但它采用石英棱鏡作單色光器，有鎢絲燈和氫弧燈兩種光源。754型分光光度計的電學(xué)部分較為復(fù)雜（圖1-9）。光電流經(jīng)過放大線路加以放大后，此時得到的樣品信號變?yōu)榕c透光率成比例的值。其后，調(diào)零、變換對數(shù)、濃度計算、打印數(shù)據(jù)等均由微處理機(jī)進(jìn)行。

儀器的使用方法

1．測試準(zhǔn)備

（1）打開電源開關(guān)之前,檢查一下試樣室是否放置遮光物。

（2）試樣槽置“參考”位置。

（3）接電源開關(guān)(如果波長工作在于200～360時需按氘燈觸發(fā)按鈕)。(參見圖1-9)

顯示器顯示“754”后，數(shù)顯而易見：“100.0”，則表示儀器已通過自檢程序。

（4）儀器預(yù)熱三十分鐘后開始測試。

測試

（1）數(shù)顯為100.0后，穩(wěn)定2～3秒鐘，即可把試樣槽置“樣品”位置進(jìn)行測試。待第-一個數(shù)據(jù)打印完畢后，再可將試樣槽置第二個“樣品”位置測試。

（2）每當(dāng)需要調(diào)換波長時，必須把試樣槽置“參考”位置，重新調(diào)滿度。

[注意]：如果在幅度設(shè)定測試波長時，需等待數(shù)分鐘后，才能工作，因這時光能量變化急劇，使光電管受光后響應(yīng)緩慢，需一段光響應(yīng)平衡時間。

三、

分光光度計的結(jié)構(gòu)原理

不論光度計(Photometers)、比色計（Colorimenters）還是分光光度計(Spectrophoto- meters)，其基本結(jié)構(gòu)原理都是相似的，都由光源、單色光器、狹縫、吸收杯和檢測器系統(tǒng)等部分組成（圖1-5）。

（一）光源

一個良好的光源要求具備發(fā)光強(qiáng)度高、光亮穩(wěn)定、光譜范圍廣和使用壽命長等特點。幾乎所有的光度計都采用穩(wěn)壓調(diào)控的鎢燈(tungsten lamp)。它適用于做340-900nm范圍的光源。更的分光光度計外加有穩(wěn)壓調(diào)控的氫燈(hydrogen lamp)。它適用于做200 -360nm的紫外分光分析的光源。

（二）單色光器

分光光度法測定某一物質(zhì)的光密度需要在某一特定波長下進(jìn)行。單色光器的作用在于根據(jù)需要選擇一定波長范圍的單色光。在實際工作中欲選擇出單個某波長的光線是困難的。所謂單色光是指在此波長有zui大發(fā)射，而在相鄰較長和較短波長范圍內(nèi)的發(fā)射能量較少而言。單色光的波長范圍愈窄，儀器的敏感度愈高，測量的結(jié)果愈可靠。

zui簡單的單色光器是光電比色計上所采用的濾光片（一定顏色的玻璃片）。由于通過光線的光譜范圍較寬，所以光電比色計的分辨效果較差，但對比色分析還是可以得到較為滿意的效果的。棱鏡(Prism)的衍射光柵(diffraction grating)是較好的單色光器。它們能在較寬光譜范圍內(nèi)分離出相對單一波長的光線（圖1-6）。

（三）狹縫

通過單色光器的發(fā)射光的強(qiáng)度可能過強(qiáng)也可能過弱不利于進(jìn)一步檢測。狹縫是由一對隔板在光通路上形成的狹縫。通過調(diào)節(jié)狹縫的大小來調(diào)節(jié)入射單色光強(qiáng)度并使入射光形成平行光線，以適應(yīng)檢測器的需要。光電比色計的狹縫是固定的，而光度計和分光光度計的狹縫大小是可調(diào)的。

（四）吸收杯

吸收杯又叫樣品杯(Sample Cell)，是光度測量系統(tǒng)的重要部分之一。在可見光范圍內(nèi)測量時選用光學(xué)玻璃吸收杯，在紫外線范圍內(nèi)測量時要選用石英吸收杯。注意保護(hù)吸收杯的質(zhì)量是取得好的分析結(jié)果的重要條件之一。不得用粗糙、堅硬物質(zhì)接觸吸收杯，不能用手指握取吸收杯的光學(xué)面；用后要用水及時沖洗，不得殘留測定液，尤其是蛋白質(zhì)和核酸溶液。

（五）檢測器系統(tǒng)

硒光電池、光電管或光電倍增管等光電元件常用來作為受光器，將通過吸收杯的光線（I）的能量轉(zhuǎn)變成電能。進(jìn)一步再用適當(dāng)?shù)姆椒y量所產(chǎn)生的電流。

光電比色計用硒光電池為受光器。硒光電池的光敏感性低。它不能檢出強(qiáng)度非常弱的光線。并且，對波長在270nm以下和700nm以上的光波不敏感。

較精密的分光光度計都是采用真空光電管或光電倍增管作為受光器的，并采用放大裝置以提高敏感度。雖然光譜范圍狹窄的單色光的能量比范圍寬的弱很多，但這種有放大線路的靈敏檢測系統(tǒng)仍可能準(zhǔn)確地檢測出來。