CCK試劑盒實(shí)驗(yàn)中的小技巧，你學(xué)會了嗎

 Cell Counting Kit簡稱 CCK 試劑盒，為MTT法的替代方法，是一種基于WST（水溶性四唑鹽，化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。 

細(xì)胞活性檢測 

1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（在37℃,5% CO2的條件下）。 

2、向每孔加入10 μL的CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。 

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。 

4、用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。 

5、如果暫時(shí)不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。 

細(xì)胞增值-毒性檢測 

1、在96孔板中配置100μL的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)（在37℃，5% CO2的條件下）。 

2、向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測物質(zhì)。 

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24或48小時(shí)）。 

4、向每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。 

5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。 

6、用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。 

7、如果暫時(shí)不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。 

注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。 

實(shí)驗(yàn)小技巧：

①建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。 

②有條件的情況下建議采用多通道移液器，可以減少平行孔減的差異。加入CCK試劑時(shí)，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基頁面下加，容易產(chǎn)生氣泡，會干擾OD值讀數(shù)。 

③白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長時(shí)間。 

④當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK溶液。 

CCK試劑盒實(shí)驗(yàn)中的小技巧，你學(xué)會了嗎