1,5-二磷酸核酮糖化酶(Rubisco)試劑盒的正確使用方法

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（ribulose-1，5-bisphosphale carboxylase，RuBPCase）是光合作用碳代謝中的重要的調(diào)節(jié)酶，是植物中最豐富的蛋白質(zhì)，主要存在于葉綠體的可溶部分，總量約占葉綠體可溶蛋白50%~60%。本實驗分別用分光光度法和同位素法測定酶的羧化能力。

二磷酸核酮糖叛化酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一個關鍵酶，既控制著 CO2的固定，同時又制約著碳素向 Calvin 循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流，其活性的大小直接影響著光合速率。測定原理;在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1,5-二磷酸RuBP)與1分子的 CO, 結(jié)合，產(chǎn)生 2分子的 3-磷酸甘油酸(PGA)，PGA 可通過外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，并使還原型輔酶I(NADH)氧化。因此，340nm 吸光度的變化可計算還原型輔酶 I氧化速率，還原型輔酶I氧化速率可反映 Rubisco 的活性。

自備的儀器和用品:

可見-紫外分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、lmL 石英比色皿、研缽、冰、蒸館水。

四、試劑的組成和配制:

提取液一: 液體 25mLx1 瓶，4C保存:提取液二:液體 25mLx1 瓶，4C保存:

試劑一: 30mLx1 瓶，4C保存:

試劑二: 粉劑x1 瓶，-20C保存，臨用前加入 12.5mL 試劑一，充分混勻備用，用不完的試劑分裝后-20C保存，禁止反復凍融:試劑三:粉劑x1 瓶，-20C保存，臨用前加入 12.5mL 試劑一，充分混勻備用，用不完的試劑分裝后-20C保存，禁止反復凍融:試劑四: 粉劑x1 瓶，-20C保存，臨用前加入 1.25mL 試劑一，充分混備用，用不完的試劑分裝后-20保存，禁止反復凍融;(注意: 試劑二、三、四濟解后，按需分裝-20C保存。)

五、樣本本處理:

1、總 Rubisco 酶提取:建議稱取約 0.1g 樣本，加入mL 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎 (冰浴，200W.

破碎 3s，間歇 7s，總時間 1min)，然后4C，8000g 離心 10min，取上清測定。

胞漿和葉體 Rubisco 的分離: 按照物組織質(zhì)量(g): 提取液體積(mL)為 1:5-10 的比例(建議稱取約 0.1g組織，加入 1mL 提取液一)，冰浴勻漿后于 4C，200g 離心5min，分離并保留沉淀，取上清在4C，8000g 下離心 10min，取上清用于測定胞漿 Rubisco 酶活性: 取沉淀加 1mL 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎(冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時間1min)，然后4C，8000g 離心 10min，取上清測定葉綠體中 Rubisco 酶活性。

建議測定總 Rubisco 活性，按照步1提取液，要分別測定胞和葉綠體中的 Rubisco，則按照步驟2 提取粗液。 (注意:粗酶液制備過程中超聲破碎操作使用細胞破碎儀進行。)

 1,5-二磷酸核酮糖化酶(Rubisco)試劑盒的正確使用方法