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支原體檢測(cè)試劑盒細(xì)胞樣本的處理妙招
本試劑盒是利用熒光染料(bisbenzimide,Hoechst 33258)檢測(cè)支原體污染。這種染料會(huì)結(jié)合到DNA的A-T富集區(qū)域,因?yàn)橹гw的DNA中A-T含量高(55%~80%),所以可將其染色而被檢測(cè)到。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后在細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點(diǎn),即為支原體的DNA染色斑,說(shuō)明有支原體污染。Hoechst 33258的最大激發(fā)波長(zhǎng)為346nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為460nm;Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后,最大激發(fā)波長(zhǎng)為352nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為461nm。
貼壁細(xì)胞:
1.被檢細(xì)胞接種于無(wú)菌的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,接種密度為1-2×104。同時(shí),接種正常無(wú)支原體感染的同種細(xì)胞,作為陰性對(duì)照。
2.5天后,先吸去培養(yǎng)液,再加入1ml的固定液,靜置20min,
3.吸去固定液,晾干。
4.于每孔中,加入1ml的Hoechst33258工作液(Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞),37℃避光放置15-20min或室溫靜置20~30min。
5.吸去Hoechst 33258工作液,加入2ml滅菌超純水洗滌三次,直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入一滴封片液,并以蓋玻片覆蓋。
6.熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā),觀察細(xì)胞周圍是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn)。
注意事項(xiàng):
1.Hoechst工作液對(duì)人體有害,請(qǐng)注意防護(hù)。
2.固定液有刺激性氣味,建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行固定。
3.支原體檢測(cè)時(shí),最好用不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)2~3代,這樣容易避免假陰性結(jié)果。
4.本試劑盒用于6孔板檢測(cè)時(shí),可以進(jìn)行50次檢測(cè)反應(yīng)。
5.檢測(cè)支原體污染,可以使用支原體高效Vero細(xì)胞,這樣可以提高檢測(cè)靈敏度,即將被檢測(cè)樣品接種于Vero細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
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