膠原酶Ⅳ型-膠原酶儲(chǔ)存液的配制

膠原酶（Collagenase）是一種蛋白酶，一種肽鏈內(nèi)切酶，能特異性的識(shí)別Pro-X-Gly-Pro序列（該序列較多出現(xiàn)在膠原中）并切割該序列中性氨基酸（X）和甘氨-酸（Gly）之間的肽鍵。許多蛋白酶都能水解單鏈且變性的膠原多肽，但膠原酶是唯-一可以降解廣泛存在結(jié)締組織內(nèi)的具有三股超螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原纖維的蛋白酶。

本品來源于溶組織梭菌，是一種酶粗提物，能夠降解天然膠原和網(wǎng)狀纖維。還含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等，分別能夠有效水解結(jié)締組織和上皮組織細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的其他蛋白，多糖和脂質(zhì)，非常適用于組織消化。

膠原酶常根據(jù)活性的差異，分為四種類型：膠原酶I型、II型、III型和IV型，在應(yīng)用范圍上有所不同。1）膠原酶I型（Type I Collagenase）：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶，酪蛋白酶，梭菌蛋白酶，胰蛋白-酶活性）。通常用作上皮細(xì)胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的制備；2）膠原酶II型（Type II Collagenase）：含有更高的梭菌蛋白酶活性，通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來源細(xì)胞的制備；3）膠原酶III型（Type III Collagenase）：含有較低的蛋白酶活性，常用于乳腺細(xì)胞的制備；4）膠原酶IV型（Type IV Collagenase）：含有低胰-酶活性，通常用于胰島細(xì)胞的制備，或者需要維持受體完整性的細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)。

使用方法

1. 膠原酶儲(chǔ)存液的配制

向每管100mg的膠原酶中加入100µL的含Ca2+、Mg2+的HBSS（Hank’s平衡-鹽溶液，含Ca2+、Mg2+），輕輕旋渦震蕩使其充分溶解，制備成1g/ml（即1000×）的儲(chǔ)存液。然后用低蛋白結(jié)合性的0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝成小份量，然后于-20℃避光凍存。

使用前于冰上解凍，避免反復(fù)凍融。其用于組織和細(xì)胞分散的常用濃度為：0.5-2.5mg/ml，用于軟骨消化的常用濃度為1-2mg/ml，需要根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)條件或者參考相應(yīng)的文獻(xiàn)資料確定所需的最佳工作濃度。

2．組織的分離

1）使用無菌手術(shù)刀或剪刀將組織切成3-4mm大小的組織塊；

2）利用含Ca2+、Mg2+的HBSS洗滌組織塊數(shù)次；

3）加入足量的含Ca2+、Mg2+的HBSS，使其浸沒組織塊，并加入膠原酶至需要工作濃度；

4）于37℃孵育4-18h。消化時(shí)使用水平搖床以及用3mM的CaCl2補(bǔ)充消化可以提高消化效率。

5） 已分散開的細(xì)胞可使用不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩篩得，收集備用。未*解離的組織另外添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃繼續(xù)孵育；

6）利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細(xì)胞數(shù)次；

7）細(xì)胞培養(yǎng)液重懸上述細(xì)胞，利用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或其他方法計(jì)算活細(xì)胞密度。

8）于細(xì)胞培養(yǎng)皿上利用合適細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞。